lang yang terjadi pada jaringan kasein (van Vliet dan Walstra, 1994). Pada gel yang baru dibuat, jumlah ikatan antara setiap sambungan belum terlalu tinggi, seperti yang ditunjukkan oleh modulus dinamik yang rendah, dan tan lebih tinggi daripada gel yang sudah tua; faktor-faktor ini mungkin menjelaskan mengapa wheying-off kadang-kadang terjadi pada gel yang masih muda tetapi lebih jarang pada gel yang sudah tua. Sineresis gel susu asam yang dibuat dengan GDL meningkat pada suhu gelasi yang tinggi, nilai pH yang tinggi dan bahkan pada tingkat rennet yang rendah (van Vliet et al., 1991; Lucey, 2004). Telah ditunjukkan baru-baru ini bahwa tekanan sineresis endogen umumnya kecil dalam gel asam yang terbuat dari natrium kaseinat dan ini menghasilkan kecenderungan yang lebih rendah dari gel ini untuk menyusut dibandingkan dengan gel yang diinduksi rennet (Lucey et al., 1997). Gel susu yang diinduksi asam yang dibentuk oleh pengasaman susu yang lambat pada suhu rendah dan di bawah pemanasan diam menunjukkan sedikit wheying-off atau sineresis spontan (Roefs, 1986). Perlu dicatat bahwa gel susu asam mengalami sineresis jauh lebih sedikit daripada gel yang diinduksi rennet bahkan ketika mengalami sentrifugasi (Lucey, 2004). Untuk alasan ini, keju yang dikoagulasi asam memiliki kadar air yang sangat tinggi (misalnya, >50%). Pengaruh Parameter Komposisi dan Pengolahan Terhadap Sifat Tekstur Gel Susu Asam Efek dari setiap langkah pemrosesan pada sifat tekstur gel susu asam akan dibahas pada bagian berikut. Pengasaman produk asam daging dengan kultur umumnya dilakukan dengan salah
␦
satu dari dua metode: lambat, 12-16 jam pada 20-23°C (set panjang) atau 4-6 jam pada 30-32°C (set pendek). Kultur bakteri asam laktat mesofilik (yaitu, terutama Lactococcus spp. dan Leuconostoc spp.) dan terkadang spesies probiotik dipakai sebagai kultur untuk sebagian besar keju yang dikoagulasi asam (Walstra et al., 2010). Terkadang, keju segar dibuat dengan penambahan asam, misalnya asam fosfat atau asam laktat (pengaturan asam langsung atau pengasaman langsung) dan/atau GDL (Orla-Jensen et al., 1947; Corbin et al., 1982; Lucey et al., 2001; Okpala et al., 2010;). Dibandingkan dengan gel yang dibuat pada 20oC asam kasein gel yang dibuat pada 40oC lebih kasar, menunjukkan lebih banyak penataan ulang, lebih lemah dan kurang stabil (Lucey et al., 1997). Dalam praktiknya, variabel proses lainnya (misalnya, kandungan lemak, stabilisator, perlakuan panas) dapat membantu menstabilkan jenis gel ini. Secara umum, laju pembentukan asam yang berlebihan (misalnya, pemakaian GDL) pada suhu inkubasi yang tinggi (misalnya, 45oC berkontribusi terhadap cacat 'wheying-off' dan pembentukan gel yang buruk. Dalam berbagai jenis gel susu asam yang dibentuk dengan GDL, suhu gelasi yang lebih rendah (misalnya, 30oC menghasilkan waktu gelasi yang lebih lama tetapi gel ini dapat memiliki nilai G' lebih tinggi daripada gel yang dibuat pada suhu gelasi yang jauh lebih tinggi misalnya, 40oC (Cobos et al., 1995; Lucey et al., 1998). Hal ini dipicu struktur gel yang lebih kasar (pengaturan ulang yang lebih besar) dalam gel GDL yang terbentuk pada suhu tinggi (Lucey et al., 1997). Dalam produk yang dikultur, tren terkait suhu gelasi ini mungkin kurang jelas karena perbedaan besar dalam laju penurunan pH antara gel yang dikultur dan diinduksi GDL. Dalam produk yang dikultur, gel yang dibuat pada suhu yang sangat rendah (misalnya, 21oC lebih lemah daripada gel yang dibuat pada suhu yang sedikit lebih tinggi (misalnya, 26oC). ) Modulus dinamis gel asam meningkat dengan menurunnya suhu pengukuran (Lucey et al., 1997; Lucy, 2004). Pemisahan whey juga menurunkan gel GDL yang dibuat pada suhu gelasi yang lebih rendah (Lucey et al., 1997, 1998). Metode pengasaman dan pembentukan gel (misalnya, GDL, pengasaman dingin atau fermentasi bakteri) memiliki dampak besar pada struktur dan sifat fisik gel susu asam (Roefs, 1986; Lucey et al., 1998d). Pemanasan cepat gel diasamkan dingin ke suhu tinggi (misalnya, 50oC menghasilkan gel yang keras tetapi sineresis yang cukup besar (Walstra et al., 2010). Perlakuan panas susu merupakan salah satu parameter proses yang paling penting yang mempengaruhi tekstur gel susu asam (Mulvihill dan Grufferty, 1995). Ketika susu dipanaskan terlebih dahulu, protein whey yang terdenaturasi bergabung dengan misel kasein dan mereka menghubungkan
jaringan gel ketika terjadi agregasi selama pengasaman susu berikutnya. Ketegasan dan viskositas gel asam telah dikaitkan dengan tingkat denaturasi protein whey selama perlakuan panas. Perlakuan panas juga menghasilkan pengurangan waktu gelasi. Dalam gel yang terbentuk dari susu yang dipanaskan sebelumnya, gelasi terjadi pada pH yang lebih tinggi (misalnya, 5,2-5,4) daripada dari susu yang tidak dipanaskan (pH ~ 5,0); nilai pH ini tergantung pada suhu gelasi. pH gelasi yang lebih tinggi dapat dikaitkan dengan pH isoelektrik yang lebih tinggi (~5,2) dari protein whey utama, beta-1actoglobulin, yang memulai pengendapan/agregasi isoelektrik pada pH yang lebih tinggi daripada kasein yang memiliki titik isoelektrik ~4,6 (Lucey et al., 1998). Perlakuan panas tinggi juga meningkatkan modulus dinamis gel susu asam (van Vliet dan Keetels, 1995; Lucey et al., 1997, 1998; Lucey, 2004) meskipun regangan patah menurun dengan meningkatnya perlakuan panas, membuat gel ini lebih rapuh (Lucey et al., 1997; Fox, 2000). Perlakuan panas dapat meningkatkan kerentanan gel GDL terhadap wheying karena gel dapat mengalami penataan ulang yang lebih besar (Lucey et al., 1998). Ada sejumlah laporan tentang efek perlakuan panas pada sifat reologi gel susu asam yang ditentukan oleh osilasi amplitudo rendah (regangan) dinamis (van Vliet dan Keetels, 1995; Lucey et al., 1997a, 1998b, c). Peningkatan cross-linking atau bridging, oleh protein whey yang didenaturasi, dalam gel yang terbuat dari susu yang dipanaskan mungkin bertanggung jawab atas peningkatan kekakuan jaringan (Lucey et al., 1997, 1998; Lucey, 2004). Telah diketahui dengan baik bahwa peningkatan kandungan padatan non-lemak (SNF) susu meningkatkan kekencangan dan viskositas gel susu asam. Kandungan protein atau SNF susu dapat ditingkatkan dengan mengkonsentrasikan susu, misalnya dengan reverse osmosis (De Boer et al., 1980), ultrafiltrasi (Cheryan, 1998), atau penguapan termal atau dengan pengayaan bahan kering (Fox et al. , 2000). Sumber bahan kering biasanya SMP dan WPC. Pada tingkat protein yang sama, gel susu asam yang diperkaya dengan Na kaseinat memiliki viskositas atau kekencangan yang lebih tinggi daripada gel yang diperkaya dengan SMP atau WPC. Penambahan 1% WPC ke dalam susu diikuti dengan perlakuan panas, menghasilkan peningkatan G' dan pengurangan waktu gelasi untuk gel susu asam (Lucey et al., 1999). Substitusi hingga 10-15% kasein oleh WPC memiliki sedikit efek pada viskositas akhir atau atribut sensorik gel susu asam tetapi pada tingkat substitusi yang lebih tinggi, flokulasi dan rasa tidak enak dapat terjadi pada produk. Kekencangan gel asam yang dibuat dari susu dengan berbagai rasio kasein terhadap protein whey adalah serupa (Jelen et al., 1987).
Sifat membran globul lemak menentukan jenis interaksi yang dapat terjadi antara globul lemak dan matriks protein. Gumpalan lemak bertindak sebagai pengisi inert jika membran globul lemak asli utuh karena membran ini tidak berinteraksi dengan partikel kasein (van Vliet, 1988). Nilai G' gel susu asam menurun dengan meningkatnya fraksi volume lemak, yang memiliki membran globul lemak asli yang utuh (van Vliet, 1988). Dalam susu homogen atau rekombinasi, membran asli sebagian besar digantikan oleh kasein dan beberapa protein whey sehingga permukaan partikel lemak dapat berinteraksi dengan matriks protein (sebagian besar kasein tetapi beberapa protein whey terdenaturasi ketika gel dibuat dari susu yang dipanaskan) asam gel susu (van Vliet dan Dentener-Kikkert, 1982; van Vliet, 1988). Sebuah pH 4,6 - 4,75 pada pemotongan sering direkomendasikan untuk keju Cottage; pH yang lebih tinggi menghasilkan koagulum yang lebih kencang sedangkan pH yang lebih rendah menghasilkan dadih yang lebih lembut (Emmons dan Tuckey, 1967; Emmons dan Beckett, 1984). PH yang lebih tinggi pada pemotongan mungkin menghasilkan retensi Ca yang lebih besar sebagai CCP dalam partikel kasein. Tolakan elektrostatik antara molekul kasein ditingkatkan dengan melarutkan CCP (Horne, 1998). Gel kasein asam dengan nilai pH yang sangat tinggi (misalnya, 4,8) memiliki kecenderungan yang jauh lebih besar untuk bersinergi daripada gel dengan nilai pH rendah (≤4,6) (van Vliet et al., 1997). Agaknya, sebagian besar CaCl2 yang ditambahkan larut pada pH rendah gel susu asam. Pengasaman susu hingga pH 4,9 melarutkan semua CCP (Pyne dan McGann, 1960). Dalam pembuatan kasein asam, Jablonka dan Munro (1986) menganggap bahwa residu Ca 2+ pada partikel kasein membentuk jembatan antara kelompok kasein yang bermuatan negatif (misalnya, fosfoserin), menghasilkan dadih yang lebih rapat, lebih padat dan partikel dadih yang lebih besar. Rennets - Aspek Umum dan Molekuler Enzim proteolitik dapat diklasifikasikan berdasarkan aktivitas katalitiknya menjadi salah satu dari empat kelompok - serin, sistein, metalo dan proteinase aspartat (Kay, 1985). Chymosin (rennin; EC 3.4.23.4) adalah proteinase aspartat neonatalgastrik dan penting secara komersial dalam pembuatan keju. Itu milik keluarga proteinase aspartat yang didistribusikan secara luas di banyak organisme dan jaringan dengan sifat fisiologis dan fungsional yang berbeda (Chitpinityol dan Crabbe, 1998). Urutan nukleotida dan asam amino dan struktur tiga dimensi dari beberapa proteinase aspartat tersedia dan memberikan informasi untuk desain rekayasa protein dari keluarga
protein ini. Enzim sekarang dapat diproduksi secara rekombinan dalam berbagai sistem ekspresi dalam jumlah yang cukup untuk studi struktural dan fungsional Proteinase aspartat Proteinase aspartat mengandung dua residu aspartil (Asp32 dan Asp215, penomoran pepsin) di situs aktif (Tang et al., 1973). Mereka rentan terhadap penghambatan oleh pepstatin, pentapeptida yang diproduksi secara alami oleh strain Streptomyces (Umezawa et al., 1970), dan pelabelan afinitas pada aspartat katalitik memakai diazoacetylnorleucinemethyl ester (DAN) dengan adanya ion tembaga (Rajagopalan et al. , 1966) atau 1,2- epoksi-3-(p-nitrofenoksi) propana (EPNP). Proteinase aspartat dapat ditemukan di seluruh alam mulai dari virus hingga tumbuhan tingkat tinggi dan mamalia. Mereka umumnya dibagi menjadi dua kelompok besar - enzim mirip pepsin dan retroviral. Enzim-enzim ini telah diisolasi dari lima sumber utama: 1. Perut. Beberapa jenis enzim lambung, pepsin (EC 3.4.23.1), pepsin B (EC 3.4.23.2), gastricsin (EC 3.4.23.3) dan chymosin (EC 3.4.23.4), diproduksi di mukosa abomasal sebagai prekursor tidak aktif, zimogen . Pepsin adalah proteinase yang dominan pada mamalia dewasa (Tang et al., 1973). Gastricsins ditemukan di semua bagian perut mamalia, atau sel pulau pankreas, kelenjar prostat dan vesikula seminalis. Chymosin diproduksi sejak awal selama kehamilan (dalam rahim) di mukosa abomasal mamalia yang baru lahir, termasuk anak sapi (Foltmann, 1970). Produksi ini enzim bervariasi, tergantung pada usia hewan dan cara makan (Andren dan Bjorck, 1986). 2. Lisosom dari banyak jenis sel mengandung cathepsin D (Hurley et al., 2000) dan cathepsin E. Cathepsin E ditemukan di mukosa lambung, timus, limpa dan sel darah (Kageyama, 1995). Katepsin D manusia mungkin terlibat dalam degradasi protein intraseluler dan endositosis, dan merupakan indikator prognostik invasi tumor payudara. Tampaknya ada peran enzim ini selama proteolisis dalam pematangan keju, paling jelas pada keju di mana aktivitas rennetnya rendah, seperti keju Swiss, Quarg dan Feta. 3. Jaringan seperti ginjal dan kelenjar submaksilaris menghasilkan renin (Kay, 1985). 4. Tanaman, termasuk labu siam, mentimun, tomat, barley, beras, gandum, sorgum dan teratai (Doi et al., 1980; Morris et al., 1985; Polanowski et al., 1985; Belozersky et al., 1989). 5. Mikroorganisme. Beberapa proteinase aspartil disekresikan oleh jamur, termasuk Cryphonectria parasitica (Sardinas, 1968), Penicillium janthinellum (Hofmann dan Shaw,
1964), Rhizomucor pusillus (Arima et al., 1970), Rhizomucor miehei (Sternberg, 1971), Rhizopus chinensis (Fumamoto et al., 1967), Aspergillus awamori (Ostoslavskaya et al., 1986), Aspergillus niger (Koaze, et al., 1964) dan Trichoderma reesei (Pitts, 1992). Proteinase telah ditemukan dalam ragi, Saccharomyces cerevisiae (MacKay et al., 1988), Candida tropicalis (Togni et al., 1991) dan Yarrowia lipolitika (Yamada dan Ogrydziak, 1983). Thermopsin disekresikan oleh Sulfolobus acidocaldarius, Archaebacterium termofilik (Lin dan Tang, 1990).
Sifat Fisik Proteinase Aspartat Kimosin dan proteinase aspartat memiliki berat molekul dalam kisaran 32-39 kDa, dengan banyak titik isoelektrik yang sesuai dengan sejumlah isozim, degradasi otomatis, dan produk pasca-translasi (Crabbe, 2004). Glikosilasi terkait-N telah ditemukan pada beberapa proteinase seperti cathepsin D (N67 dan N183) 5. cerevisiae proteinase A (N67 dan N263), rhizomucor protease (N173) dan renin manusia (N07). Kimosin paling stabil pada nilai pH antara 5,3 dan 6,3. Namun, bahkan pada pH 2, chymosin relatif stabil (Foltmann, 1959). Di bawah kondisi asam (pH 3-4), enzim kehilangan aktivitasnya dengan cepat, mungkin dipicu oleh autodegradasi, sedangkan pada nilai pH basa (di atas 9,8), kehilangan dipicu oleh perubahan konformasi ireversibel (Cheeseman, 1965). Kehilangan aktivitas chymosin A lebih tinggi daripada chymosin B (Foltmann, 1966). Chymosin lebih stabil pada suhu 2oC dibandingkan pada suhu kamar (Foltmann, 1959). Kawaguchi et al. (1987) melaporkan hilangnya aktivitas chymosin dengan cepat ketika suhu dinaikkan dari 45 menjadi 55oC. Prochymosin lebih stabil daripada chymosin pada pH netral (Foltmann, 1966). Pada nilai pH di bawah 5.0, prokimosin diubah menjadi chymosin sedangkan pada pH di atas 11,0 stabilitas prokimosin hilang karena perubahan konformasi. Pseudochymosin stabil pada pH asam selama berhari-hari tetapi dengan cepat diubah menjadi chymosin jika pH meningkat di atas 4,5 (Barkholt et al., 1979). Rhizomucor protease, Cryphonectria protease dan S. cerevisiae proteinase A stabil pada pH 3,5-7,0 (Sardinas, 1968; Bailey dan Siika-aho, 1988). Pepsin menunjukkan stabilitas umum yang lebih besar daripada chymosin; misalnya, sesudah inkubasi dalam 6 mol/1 urea pada 37oC selama 30 menit, hanya 10% dari aktivitas awal yang hilang (Cheeseman, 1965). Proteinase aspartat yang mengandung karbohidrat lebih stabil terhadap suhu tinggi, denaturan dan degradasi dibandingkan protein tanpa karbohidrat (Aikawa et al., 1990; Berka et al., 1991; Brown dan Yada, 1991). Glikosilasi protease rhizomucor baik dengan modifikasi kimia
┫
atau genetik memicu hilangnya stabilitas dan peningkatan rasio aktivitas pembekuan susu terhadap aktivitas proteolyric (C/P rasio) (Brown dan Yada, 1991; Aikawa et al., 1990). Kelarutan chymosin dipengaruhi oleh pH, suhu dan kekuatan ionik larutan (Foltmann, 1959). Kimosin yang tidak mengkristal larut dalam larutan yang mengandung 1 mol/l NaCl dan pada pH 5,5. Dalam larutan >2 mol/l NaCl, chymosin tampaknya tidak larut. Kimosin yang mengkristal menunjukkan kelarutan yang lebih tinggi pada 25oC daripada pada 2oC (Foltmann, 1970); namun, endapan amorf chymosin lebih stabil pada 2oC daripada pada 25oC. Pada nilai pH yang mendekati titik isoelektrik, chymosin sangat tidak larut pada kekuatan ion 0,005; kelarutannya meningkat dengan meningkatkan kekuatan ioniknya (Crabbe, 2004).
Gambar 11 Mekanisme katalitik yang diusulkan untuk proteinase aspartate Sumber: Veerapandian, et al (1990) Struktur Proteinase Aspartat DNA genom dari proteinase aspartat unggas dan mamalia, pepsinogen embrionik ayam (Hayashi et al., 1988), renin manusia (Miyazaki et al., 1984), kimosin sapi (Hidaka et al., 1986) dan pepsinogen manusia (Sogawa et al., 1983), terdiri dari sembilan ekson yang dipisahkan oleh delapan intron, dan semua titik persimpangan ekson-intron sangat kekal. Hasil ini mendukung keyakinan bahwa gen untuk enzim ini telah berevolusi dari gen nenek moyang yang sama. Sebaliknya, pada beberapa proteinase aspartat mikroba, termasuk S. cerevisiae (Ammerer et al.,
┢
1986), C. tropicalis (Togni et al., 1991), R. pusillus (Tonouchi et al., 1986) dan R. miehei (Gray et al., 1986), tidak ada intron yang ditemukan dalam gen untuk enzim ini. Namun, dalam gen untuk proteinase aspartat R. niveus (Horiuchi et al.,1988) dan A. awamori (Berka et al., 1991), masing-masing ditemukan satu dan tiga intron pendek, tetapi ekson-intronnya junction berada pada posisi yang berbeda dari yang ada pada gen untuk proteinase aspartat mamalia dan unggas. Kimosin anak sapi ditemukan dalam dua bentuk utama, A dan B, chymosin B lebih melimpah. Kimosin A dan B berbeda hanya pada satu posisi asam amino: kimosin A memiliki residu aspartat pada posisi 243 (penomoran pepsin), sedangkan ini adalah residu glisin dalam kimosin B. Bentuk ketiga, kimosin C, tampaknya merupakan produk degradasi dari chymosin A yang tidak memiliki tiga residu, D244-F246 (Danley dan Geoghegan, 1988). Sangat mungkin bahwa kimosin A dan B disintesis dari alel berbeda dari gen polimorfik yang sama, bukan dari beberapa keluarga gen, karena hanya satu lokus gen kimosin yang ditemukan dari hibridisasi genom anak sapi dengan gen kimosin (Donnelly et al., 1986). Urutan sekresi cenderung kaya akan asam amino hidrofobik. Ada sejumlah variabel residu sistein dalam urutannya tetapi posisinya, jika ada, dipertahankan. Oleh karena itu, ada potensi untuk dua jembatan disulfida dalam enzim Rhizomucor dan Rhizopus, jembatan disulfida tunggal dalam enzim Cryphonectria, Penicillium dan Aspergillus, dan tidak ada jembatan disulfida dalam proteinase aspartat Irpex (Crabbe, 2004). Mekanisme katalitik proteinase aspartat telah dimodelkan berdasarkan analisis struktural dari beberapa kompleks penghambat proteinase aspartat. Veerapandian et al. (1990) telah mengusulkan model mekanistik katalitik yang diuraikan dalam Gambar 12. Hidroksil pro-R (seperti statin) dari karbonil hidrat tetrahedral terikat hidrogen pada oksigen luar D32 dan D215. Oksigen hidroksil kedua dari hidrat adalah ikatan hidrogen hanya dengan oksigen karboksil D32. Karbonil ikatan scissile diproton oleh D32 dan secara simultan diserang oleh molekul air yang terpolarisasi menjadi keadaan nukleofilik oleh D215. Gerakan kaku dalam kompleks enzim-substrat dapat mendorong distorsi ikatan amida dan memfasilitasi serangan air nukleofilik pada karbonil terpolarisasi. Jadi, dalam intermediet tetrahedral I, D31 yang bermuatan negatif distabilkan oleh ikatan hidrogen yang ekstensif (Veerapandian et al., 1990). Aktivasi Zymogen dari Proteinase Aspartat Struktur pepsinogen babi telah disempurnakan pada resolusi tinggi (James dan Sielecki, 1986; Sielecki et al., 1991; Hartsuck et al., 1992). Perbandingan struktural antara pepsin dan
┣
pepsinogen menunjukkan bahwa struktur enzim dan proenzim sangat mirip. Sebagian besar perbedaan terjadi pada kedekatan celah yang, pada pepsinogen, ditutupi dan diisi oleh pro-part (1P-44P) dan 13 residu pepsin pertama. Perpanjangan 13 residu mengadopsi konformasi yang sama sekali berbeda dalam bentuk aktif dan zymogen (James dan Sielecki, 1986). Struktur sekunder zymogen terutama terdiri dari beta-sheet, dengan perkiraan sumbu simetri 2 kali lipat (James dan Sielecki, 1986). Peptida aktivasi dikemas ke dalam celah situs aktif, dan N-terminus (2P-9P) menempati posisi N-terminus matang (2-9) sejak sepuluh asam amino pertama dari bentuk pro-part [3-untai aN pepsinogen. Oleh karena itu, perubahan sesudah aktivasi termasuk eksisi peptida aktivasi dan relokasi yang tepat dari N-terminus yang matang. Pada pH netral atau basa, pro-segmen pepsin mengikat dan distabilkan di situs aktif antara dua lobus dengan interaksi elektrostatik, hidrogenbonding dan hidrofobik yang berkontribusi pada pengikatan antara pro-segmen dan sisa protein (Sielecki et al., 1991). Penurunan pH memprotonasi residu asam pada bagian enzim matang dari molekul, sehingga mengganggu interaksi elektrostatik yang menguntungkan dengan residu asam amino bermuatan positif pada segmen pro. Perubahan konformasi berikutnya dari zymogen memicu pembelahan proteolitik intramolekul yang membebaskan pro-segmen dari zymogen (Nielsen dan Foltmann, 1993). Konsentrasi tinggi NaCl atau (NH4)2SO4 meningkatkan aktivitas hidrolitik pepsin dan proteinase retroviral, selain memperluas spesifisitasnya (Kotler et al., 1989; Tropea et al., 1992). Proteinase aspartat memiliki kantong pengikat substrat yang diperpanjang yang dapat menampung setidaknya tujuh residu asam amino. Studi struktural rinci kompleks proteinase-inhibitor aspartat telah dipakai untuk mengidentifikasi residu asam amino di setiap subsitus (Cooper et al., 1987; Foundling et al., 1987; James dan Sielecki, 1987; Suguna et al., 1987). Aspartat Proteinase Inhibitor Semua proteinase aspartat dihambat oleh pepstatin, dengan mengikat gugus hidroksil statin ke dua aspartat katalitik (Marciniszyn et al., 1976). Konstanta penghambatan (Ki ) pepstatin untuk chymosin yang ditentukan pada pH 6,0 dan 3,2 masing-masing adalah 2,2 x 10-7 mol/1 dan 3,2 x 10-8mol/1 (Powell et al., 1985). Pepsin dan cathepsin juga menunjukkan ketergantungan pH dari efek penghambatan (Baxter et al., 1990), dan psuedochymosin lebih sensitif terhadap pepstatin daripada chymosin (McCaman et al., 1985). Karena pepstatin relatif tidak efektif terhadap chymosin anak sapi, inhibitor analog telah dikembangkan (Powell et al., 1985; Chitpinityol dan
┤
Crabbe, 1998; De Simone, 2010). Kimosin dihambat oleh pro-bagian pepsinogen ayam (nilai Ki 8 x 10-8 mol/l pada pH 5,6) tetapi tidak oleh pro-segmennya sendiri (Strop et al., 1990). Mekanisme Pembekuan Susu Dalam susu, protein larut utama adalah protein whey, alfa-laktalbumin dan beta-1aktoglobulin. Dengan adanya chymosin, pembekuan susu terjadi dalam dua langkah terpisah. Beberapa faktor yang mempengaruhi proses pembekuan susu, termasuk pH, suhu, kekuatan ionik, konsentrasi enzim dan garam (Okigbo et al., 1985; Bringe dan Kinsella, 1986). Reaksi bergantung pada pH; pada pH tinggi (6,6-6,7), waktu pembekuan dan kekentalan dadih berkurang (Okigbo et al., 1985), sedangkan pada pH rendah (3-4), aktivitas hidrolitiknya tinggi dan terjadi penurunan hasil dadih. Umumnya, pembekuan susu dilakukan pada pH 6,3-6,6; hanya ketika pengasaman langsung dipakai , koagulasi rennet terjadi pada nilai pH hingga 5,6. Meningkatkan suhu di atas 30-32oC atau mengurangi pH dari 6,6 memungkinkan flokulasi pada persentase yang lebih rendah dari hidrolisis kappa-kasein (Dalgleish, 1982). Namun, induksi pembentukan gel pada 35oC membutuhkan hidrolisis sekitar 65% kappa-kasein (Carlson et al., 1986). Perbedaan konstituen susu (baik protein maupun bahan kimia lainnya) serta proses pra-perlakuan dapat mempengaruhi laju tahap enzimatik primer. Waktu yang dibutuhkan untuk mengentalkan susu berkurang dengan meningkatnya konsentrasi enzim, tetapi pembentukan dan kekencangan gel tidak berubah (Bringe dan Kinsella, 1986). Aktivitas pembekuan susu juga bergantung pada sumber chymosin; misalnya, chymosin babi delapan kali lebih aktif pada susu babi daripada pada susu sapi; chymosin anak sapi hanya setengah aktif pada susu babi seperti pada susu sapi dan aktivitas chymosin domba sekitar 20% lebih tinggi pada susu sapi daripada pada susu sapi (Foltmann, 1992). Konsentrasi ion kalsium mempengaruhi pembekuan susu dengan membentuk jembatan antara misel untuk membentuk koagulum dan meminimalkan variabilitas yang timbul dari inkonsistensi dalam komposisi susu (Bringe dan Kinsella, 1986). Namun, Pyne (1955) melaporkan bahwa ion lain, seperti strontium, magnesium dan barium, dapat mempengaruhi kebutuhan Ca2+ untuk koagulasi. Pembekuan susu dihambat oleh anion (Bringe dan Kinsella, 1986).
┥
Chymosin Betis Rekombinan Chymosin telah dipakai sebagai enzim pembekuan susu untuk produksi industri keju. Beberapa pengganti rennet telah dipakai , termasuk pepsin sapi (dari sapi dewasa), proteinase jamur dan enzim proteolitik lainnya. Namun, mereka memiliki tingkat aktivitas proteolitik non-spesifik yang jauh lebih besar, dan dalam beberapa kasus termostabilitas yang lebih tinggi yang memicu lebih banyak degradasi protein susu menjadi peptida, yang mengarah pada penurunan hasil dan pengembangan rasa yang buruk pada beberapa jenis keju (Crabbe, 2004). Akibatnya, ada banyak upaya untuk menghasilkan chymosin dalam mikroorganisme. Laporan pertama dari upaya untuk memproduksi chymosin di E. coli adalah dari Uchiyama et al. (1980). Upaya untuk mengekspresikan prochymosin cDNA dalam E. coli memicu akumulasi intraseluler dari chymosin tidak aktif dalam bentuk badan inklusi (McCaman et al., 1985; Kawaguchi et al., 1987). Perbaikan dalam produksi chymosin rekombinan di E. coli telah dilakukan berturut-turut dikembangkan dengan seleksi strain inang, modifikasi plasmid dan optimalisasi kondisi budidaya (Kawaguchi et al., 1987; Crabbe, 2004). Sistem ekspresi bakteri lain yang dipakai untuk memproduksi prokimosin termasuk Lc. lactis, Bacillus subtilis dan bentuk L dari Proteus mirabilis (Kapralek et al., 1991; Parente et al., 1991; Simons et al., 1991). Biang ragi Pemula-Aspek Umum Fungsi utamanya adalah untuk menghasilkan asam laktat dari laktosa selama pembuatan dan memicu perubahan biokimia selama pematangan, yang membantu mengembangkan rasa khas keju yang dibuat. LAB yang terlibat disebut Kultur Primer. Organisme ini juga disebut bakteri starter karena mereka 'memulai' (memulai) produksi asam laktat. Umumnya, bakteri starter dipilih secara hati-hati dan sengaja ditambahkan ke dalam susu sebelum pembuatan keju tetapi, untuk beberapa keju di Mediterania, tidak ada starter yang ditambahkan (Parente dan Cogan, 2004). Sebaliknya, pembuat keju mengandalkan kontaminan tambahan yang ada dalam susu yang dipakai untuk membuat keju. Spesies utama yang terlibat termasuk Lactococcus lactis, Leuconostoc sp., Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp, lactis, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus dan Lb. helveticus tetapi tidak semuanya dipakai di setiap jenis keju. Dua organisme pertama dipakai di sebagian besar varietas keju sedangkan yang kedua dipakai dalam keju seperti Emmental dan Parmigiano Reggiano dan keju Mozzarella, yang dipanaskan hingga suhu tinggi selama pembuatan (Parente dan Cogan, 2004). Dalam banyak keju
┦
artisanal, terutama yang diproduksi di negara-negara Mediterania, BAL lainnya, termasuk Lb. casei, Lb. plantarum, Ec. faecalis, Ec faecium, Lb. salivarius, dan spesies Staphylococcus juga ditemukan. organisme tidak memiliki fungsi dalam produksi asam dan disebut Kultur Sekunder. Peran utama mereka adalah untuk menghasilkan perubahan organoleptik dan biokimia dalam atau pada keju. Sampai saat ini, sulit untuk membedakan antara strain dari spesies yang sama tetapi munculnya teknik molekuler modern, khususnya elektroforesis gel natrium dodesil sulfat poliakrilamida (SDS-PAGE), DNA polimorfik yang diamplifikasi secara acak (RAPD) dan elektroforesis gel bidang pulsa (PFGE) telah mengubah ini secara signifikan. Banyak isolat dari kultur keju alami menunjukkan heterogenitas yang cukup besar dan teknik ini telah terbukti sangat berguna dalam menentukan berapa banyak strain yang ada (Giraffa et al., 1998). Divergensi dalam urutan DNA Lc. lactis subsp. lactis dan Lc. lactis subsp. cremoris diperkirakan antara 25 dan 30% (Godon et al., 1992). Lc. lactis subsp. lactis berbeda dari Lc. lactis subsp. cremoris di 9-10 bp di urutan wilayah V1 dari gen 16S rRNA dan ini telah memungkinkan probe DNA spesifik untuk spesies yang berbeda dari lactococci dan leuconostocs untuk dirancang (Klijn et al., 1991). Sebuah metode baru untuk membedakan antara Lc. lactis subsp. lactis dan Lc. lactis subsp. cremoris diusulkan oleh Nomura et al.(1999), yang menunjukkan bahwa Lc. lactis subsp. lactis menghasilkan asam gamma-aminobutirat dengan dekarboksilasi glutamat sementara Lc. lactis subsp. cremoris tidak. Kelly dan Ward (2002) telah melaporkan bahwa strain Lc. lactis subsp. cremoris yang memiliki fenotip lactis dapat diisolasi dalam jumlah rendah dari lingkungan susu dan tanaman; sebaliknya, yaitu Lc lactis subsp. lactis dengan fenotip cremoris juga dapat ditemukan tetapi jarang (Parente dan Cogan, 2004). Jenis Biang ragi Kultur starter dapat diklasifikasikan berdasarkan fungsi, suhu pertumbuhan atau komposisinya. Starter primer terlibat terutama dalam produksi asam laktat dari laktosa, yang terjadi pada awal produksi keju. Oleh karena itu, sejumlah besar sel aktif ditambahkan ke dalam susu keju. Namun, banyak dari mereka juga menghasilkan senyawa volatil, misalnya diacetyl dari sitrat, yang merupakan komponen rasa penting dari keju segar, dan CO2 dari laktosa (spesies heterofermentatif) dan sitrat (spesies homofermentatif dan heterofermentatif) yang berkontribusi pada tekstur terbuka beberapa keju. keju (Parente dan Cogan, 2004). Sistem proteolitik mereka
┧
juga terlibat dalam pengembangan rasa dan aroma dalam pematangan keju. Selain itu, dengan menurunkan pH, dengan bersaing dengan pembusuk dan mikroorganisme patogen dan dengan memproduksi senyawa antimikroba, mereka juga berkontribusi pada keamanan mikroba keju (Parente dan Cogan, 2004). Starter primer biasanya diklasifikasikan sebagai mesofilik atau termofilik. Yang terakhir adalah karakteristik varietas keju Italia (Grana, Pecorino, Mozzarella) dan Swiss (Emmentaler, Sbrinz, Gruyere), di mana suhu tinggi (>37°C tetapi umumnya 48-52°C berlaku selama fase awal pembuatan keju. dipakai pada semua varietas keju di mana suhu dadih selama tahap awal produksi asam tidak melebihi 40°C (Cheddar, Gouda, Edam, Camembert, dll.). Namun, perbedaan ini kehilangan maknanya, karena spesies mesofilik dan termofilik sering ditemukan (atau dipakai ) bersama-sama dalam starter campuran dan tertentu untuk pembuatan keju seperti Mozzarella (Limsowtin et al., 1996; Parente et al., 1997) dan Cheddar (Beresford et al., 2001) . Biang ragi Pemula Alami Kultur starter alami direproduksi setiap hari di pabrik keju dengan beberapa bentuk backslopping (yaitu, pemakaian batch lama produk fermentasi untuk menginokulasi yang baru) dan/atau dengan penerapan tekanan selektif (perlakuan panas, suhu inkubasi, suhu rendah). pH). Tidak ada tindakan pencegahan khusus yang dipakai untuk mencegah kontaminasi dari susu mentah atau dari lingkungan pembuatan keju dan kontrol media dan kondisi kultur selama reproduksi starter sangat terbatas (Parente dan Cogan, 2004). Akibatnya, bahkan di pabrik keju mana pun, starter alami terus berkembang, campuran tak terdefinisi yang terdiri dari beberapa galur dan/atau spesies BAL. Komposisi dan teknik untuk produksi starter artisanal telah ditinjau oleh Limsowtin et al. (1996). Kultur whey alami disiapkan dengan menginkubasi beberapa whey yang dikeringkan dari tong keju semalaman di bawah kondisi yang kurang lebih selektif. Komposisi dan keanekaragaman hayati kultur sangat bergantung pada selektivitas kondisi inkubasi (Parente dan Cogan, 2004). Dalam pembuatan keju Parmigiano Reggiano dan Grana Padano, whey dikeluarkan untuk tong keju pada akhir pembuatan keju pada 48-52°C dan diinkubasi semalaman pada suhu yang terkendali (45°C atau dalam wadah besar di mana suhunya turun hingga 37-40°C hingga pH akhir serendah 3,3 (Limsowtin et al., 1996) Kultur whey yang dihasilkan (siero-fermento, siero-innesto) didominasi oleh strain acidurik dan/atau thermophilik; Lb. helveticus biasanya mendominasi (>85%), tetapi spesies lain (Lb. delbrueckii subsp. lactis, Lb. fernentum,
┨
Sc. therrnophilus) mungkin ada.Variasi musiman dan geografis dalam komposisi dan kinerja kultur telah diamati. pemakaian kultur starter alami memiliki kelebihan dan kekurangan. Mereka adalah sumber galur yang sangat berharga dengan sifat teknologi yang diinginkan (ketahanan fag, produksi antimikroba, produksi aroma), meskipun banyak galur menunjukkan kemampuan produksi asam yang terbatas ketika dibudidayakan sebagai kultur murni (Cogan et al., 1997). Starter Strain Campuran (MSS) Ketika kultur yang tidak ditentukan diperbanyak dalam kondisi terkontrol dengan subkultur minimum, stabilitas komposisi dan kinerjanya sangat meningkat, tanpa kehilangan keunggulan toleransi terhadap infeksi fag (Stadhouders dan Leenders, 1984). Starter regangan campuran, yang diperoleh dengan pemilihan starter alami yang cermat, dipelihara, disebarkan dan didistribusikan oleh perusahaan starter dan lembaga penelitian, dan dipakai secara luas untuk produksi keju di Eropa. Strain campuran starter biasanya diklasifikasikan sebagai mesofilik atau termofilik, dengan suhu pertumbuhan optimum masing-masing 28-30°C dan 42°C (Limsowtin et al., 1996). MSS mesofilik dapat diklasifikasikan lebih lanjut berdasarkan fermentasi dan komposisi sitrat, sebagai starter 'O' sitrat-negatif (yang mengandung Cit-Lc. lactis subsp. lactis dan cremoris penghasil asam) atau starter L, D dan DL sitrat-positif (mengandung Leuc.mesenteroides subsp, cremoris, Cit + Lc. lactis subsp. lactis, atau keduanya, selain strain penghasil asam). MSS termofilik dipakai untuk produksi varietas keju Italia dan Swiss, dan biasanya mengandung Sc. thermophilus sendiri atau dalam campuran dengan lactobacilli termofilik (Lb. delbrueckii subsp. lactis, Lb. helveticus) (Glattli, 1990). Karena mereka berasal dari biakan yang direproduksi dalam tanaman keju tanpa perlindungan dari fag yang mengganggu, MSS mengandung banyak galur yang resisten terhadap fag tetapi juga menyimpan fag mereka sendiri (Stadhouders dan Leenders, 1984; Limsowtin et al., 1996; Josephsen et al., 1999; Bissonnette et al., 2000). Pengembangan MSS untuk produksi keju Belanda di NIZO (Stadhouders and Leenders, 1984) dan MSS termofilik (Rohmischkulturen) untuk pembuatan varietas keju Swiss oleh Swiss Federal Dairy Research Station (Glattli, 1990) adalah dua contoh keberhasilan pengembangan dan pemakaian MSS jangka panjang (Limsowtin et al., 1996). Bahkan jika MSS memiliki sejarah panjang keberhasilan pemakaian tanpa penghambatan parah oleh fag, seseorang tidak boleh terlalu yakin bahwa infeksi fag tidak akan pernah dialami.
┩
Studi yang dipublikasikan tentang pemantauan jangka panjang interaksi fag/starter di pabrik keju memakai MSS jarang terjadi. Josephsen et al. (1999) telah mendokumentasikan perkembangan fag virulen di sebuah pabrik yang telah memakai MSS yang sama hampir terus menerus sebelum masalah pengasaman lambat sesekali dialami. Isolat dari MSS yang fag homolognya terdeteksi dalam whey keju meningkat dari 16 menjadi 97% selama 11 tahun, dan virulensinya meningkat pesat (Josephsen et al., 1999). Faktanya, sementara fag yang diisolasi ketika tidak ada masalah pengasaman memiliki jangkauan inang yang terbatas, waktu laten yang lama (38-52 menit) dan ukuran ledakan yang relatif rendah (35-84), fag yang diisolasi pada tahun terakhir memiliki jangkauan inang yang lebih luas (dan mampu untuk berkembang biak pada galur yang sangat resisten terhadap fag), mengurangi waktu laten (35 menit) dan sangat meningkatkan ukuran ledakan (120-200) (Parente dan Cogan, 2004). DSS mesofilik berasal dari Selandia Baru pada tahun 1930-an, sebagai respon terhadap terjadinya cacat tekstur terbuka pada keju Cheddar yang diproduksi dengan MSS yang mengandung strain Cit+. Sejarah sistem DSS mesofilik di Selandia Baru, Australia, Amerika Serikat dan Irlandia telah ditinjau oleh Limsowtin et al. (1996). Karena rasio regangan dan/atau spesies dalam DSS ditentukan, kinerja teknologinya sangat dapat direproduksi. Ini jelas merupakan properti yang sangat diinginkan di pabrik keju modern dengan produksi susu yang besar dan jadwal produksi yang ketat. Karena hanya sejumlah strain yang dipakai (umumnya 2-6), infeksi fag mungkin memiliki konsekuensi yang merusak pada aktivitas starter (Parente dan Cogan, 2004). DSS termofilik juga tersedia secara komersial untuk produksi berbagai jenis keju Italia dan Swiss. Starter terdiri dari strain tunggal atau ganda Sc. thermophilus masih lebih disukai di Italia untuk produksi keju Mozzarella dengan kelembapan tinggi, tetapi asosiasi Sc. thermophilus dan Lb. delbrueckii subsp, bulgaricus (batang: kultur starter kokus) dipakai untuk pembuatan keju Mozzarella dengan kelembapan rendah (Kinstedt, 1993; Oberg dan Broadbent, 1993). pemakaian Lb. helveticus menggantikan Lb. delbrueckii subsp, bulgaricus telah diklaim memiliki beberapa keuntungan (Oberg et al., 1991) seperti pengurangan waktu pembuatan dan peningkatan sifat fungsional. Mekanisme resistensi fag tampaknya kurang tersebar luas di antara kultur starter termofilik daripada di lactococci (Coffey dan Ross, 2002). Menurut Moineau, (1999), karena kisaran inang Sc yang relatif sempit. thermophilus phage, pemakaian rotasi dan BIMs masih diandalkan untuk mengendalikan infeksi phage pada kultur starter thermophilic.
┪
Metabolisme Kultur Pemula Metabolisme Gula Laktosa adalah gula utama dalam susu dan pengangkutannya, metabolisme dan regulasinya dalam beberapa kultur starter yang berbeda telah ditinjau (Poolman, 1993, 2002) dan tidak akan ditinjau lebih lanjut di sini. Penerapan NMR sangat berguna dalam memahami fluks melalui jalur yang berbeda selama pertumbuhan dan dalam memahami regulasi berbagai aspek metabolisme di BAL dan literatur telah ditinjau oleh Ramos et al. (2002). NMR juga berguna dalam memahami produksi eksopolisakarida (EPS). Dalam kasus metabolisme glukosa, hasil telah menunjukkan bahwa tingkat konsumsi fruktosa-1,6-bifosfat dan besarnya potensi PEP (~PGA + PEP) jauh lebih tinggi ketika Lc. lactis tumbuh di bawah aerobik daripada di bawah kondisi anaerobik, menyiratkan bahwa aktivitas NADH oksidase adalah penting (Parente dan Cogan, 2004). Metabolisme Sitrat Sitrat hadir pada konsentrasi rendah dalam susu dan dimetabolisme oleh Leuconostoc subsp, dan beberapa strain Lc. lactis subsp. lactis ke CO2, yang bertanggung jawab untuk pembentukan mata di beberapa keju, dan diacetyl dan asetat, yang merupakan komponen rasa penting dalam susu fermentasi. Organisme yang terakhir disebut Sc. diacetylactis dalam literatur lama dan baru-baru ini Lc. lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis (Fox, 2000). Nama ini tidak memiliki status taksonomi dan cara yang benar untuk merujuknya adalah pemanfaatan sitrat (Cit +) Lc. laktis subsp, laktis. Cit + strain Lc. lactis berbeda dari strain noncitrate-utilizing (Cit-) yang lebih normal dalam mengandung plasmid yang mengkode transport sitrat (Parente dan Cogan, 2004). Metabolisme sitrat di BAL telah ditinjau oleh Hugenholtz (1993). Dalam beberapa tahun terakhir, banyak upaya telah dicurahkan untuk memahami energetika transportasi sitrat di Leuc. mesenteroides dan Lc. lactis (Garcia-Quintans et al., 1989; Marty-Teyssett et al., 1996; Magni et al., 1999). Dengan tidak adanya sumber karbon lain, Lc. mesenteroides dan Lc. lactis mengangkut sitrat dalam persamaan dengan proton, yang mengarah pada pembangkitan ApH atau gaya gerak proton. Dengan adanya D-laktat dan glukosa, sitrat diangkut oleh sistem antiport dengan laktat yang diekstrusi; dalam hal ini, metabolisme sitrat juga lebih cepat. Hal ini dipicu oleh fakta bahwa pertukaran antara sitrat dan laktat jauh lebih cepat daripada sistem symport sitrat/H+. Karena D-laktat adalah produk metabolisme gula, pengangkut yang beroperasi di bawah kondisi fisiologis mungkin adalah untuk sitrat/laktat. Pertukaran sitrat/D-laktat elektrogenik terjadi,
☫
menghasilkan gradien elektrokimia proton melintasi membran (Parente dan Cogan, 2004). Ini dapat berkontribusi secara signifikan terhadap peningkatan pertumbuhan Leuc. mesenterika selama co-metabolisme glukosa dan sitrat. Co-metabolisme glukosa dan sitrat oleh Leuconostoc subsp, menghasilkan tingkat pertumbuhan yang lebih cepat. Ini telah dikaitkan dengan pergeseran metabolisme dalam jalur glukosa, yang mengarah ke peningkatan produksi ATP (Cogan, 1987). Hasil dari Marty-Teysset et al. (1996) menyatakan bahwa pertukaran sitrat/D-laktat juga terlibat dalam produksi energi. Di Lc. lactis, co-metabolisme sitrat dan gula tidak menghasilkan efek besar pada laju pertumbuhan pada pH netral. Namun, pada nilai pH asam (4,5), sistem transportasi sitrat diinduksi. Metabolisme sitrat menghasilkan peningkatan pH ke nilai di mana konsumsi glukosa dimulai (Garcia-Quintans et al., 1989). Baru-baru ini, telah disarankan (Magni et al., 1999) bahwa induksi jalur metabolisme sitrat dalam kondisi asam membuat sel lebih tahan terhadap efek penghambatan laktat. Metabolisme Nitrogen Metabolisme nitrogen oleh starter memiliki dampak besar pada aktivitas mereka dan kualitas keju. Untuk menjalankan fungsi utama produksi asam dalam susu dan dadih, BAL harus tumbuh hingga jumlah yang tinggi, dari ~1 x 106 cfu/ml dalam susu yang diinokulasi hingga ~1 x 109 cfu/g dalam dadih keju; sineresis dadih karena pengusiran whey juga berkontribusi pada peningkatan jumlah sel. Bakteri asam laktat adalah mikroorganisme rewel dan tidak mampu mensintesis banyak asam amino, vitamin dan basa asam nukleat. Tergantung pada spesies dan strainnya, BAL membutuhkan 6 sampai 14 asam amino yang berbeda (Chopin 1993; Kunji et al., 1996). Meskipun susu kaya akan nitrogen, ia hadir terutama sebagai protein. Telah dihitung bahwa jumlah asam amino bebas dan peptida dengan berat molekul rendah yang ada dalam susu hanya dapat mendukung pertumbuhan terbatas (10-20% dari biomassa akhir kultur lactococci yang tumbuh penuh; Thomas dan Pritchard, 1987). Oleh karena itu, pertumbuhan lebih lanjut memerlukan hidrolisis protein susu. Faktanya, pertumbuhan banyak BAL bersifat diauxic dalam susu; tingkat pertumbuhan cepat awal, di mana asam amino bebas dan peptida dipakai , diikuti oleh tingkat yang sedikit lebih lambat di mana peptida dan asam amino lebih lanjut diperoleh dengan hidrolisis kasein. Proteolisis adalah peristiwa besar dalam pematangan keju; sistem proteolitik starter primer dan mikroflora sekunder menyumbang produksi ratusan senyawa rasa melalui produksi peptida dan asam amino dengan
☢
berat molekul rendah dan katabolisme selanjutnya. Peran proteolisis dan katabolisme asam amino dalam keju telah dibahas oleh beberapa ulasan baru-baru ini (Yvon dan Rijnen, 2001; Mansour et al., 2008) Starter laktat mendegradasi kasein dan peptida besar yang diturunkan dari kasein yang diproduksi oleh susu dan enzim koagulan oleh proteinase selubung (CEE lactocepin, EC 3.4.21.96, juga disebut proteinase yang terikat pada dinding sel; Kunji et al., 1996; Siezen, 1999 ). Semua CEP dari LAB yang dijelaskan hingga saat ini adalah serin-proteinase yang terkait dengan subtilisin. CEP dari Lc. lactis (PrtP) adalah yang paling luas dicirikan. Gen proteinase (prtP), yang mungkin terletak pada plasmid atau pada kromosom, mengkode protein asam amino 1902 (Lc. lactis WG2 dan NCDO763) atau 1962 (Lc. lactis SK11); ukuran yang lebih besar adalah karena duplikasi dekat C-terminus (Parente dan Cogan, 2004). CEP lebih lanjut telah dikarakterisasi dalam termofilik (Lb. helveticus, PrtH; Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, PrtB) dan Lactobacilus mesofilik (Lb. paracasei, Lb. rhamnosus). Mereka semua milik keluarga subtilase dan berbagi banyak properti dengan PrtP lactococcal, meskipun kekhususan dan struktur domain mungkin berbeda (Parente dan Cogan, 2004). Domain katalitik PrtP, PrtB dan PrtH menunjukkan derajat homologi yang lebih tinggi dibandingkan domain lainnya. Pelepasan CEP laktobasilus termofilik ke dalam media membutuhkan perawatan drastis (lisozim, syok osmotik, pelarutan membran); meskipun mereka tidak memiliki domain AN, domain W sangat mendasar dan dapat berikatan dengan dinding sel melalui interaksi elektrostatik (Rodriguez et al., 2009). Degradasi asam amino memiliki implikasi penting untuk metabolisme kultur starter (misalnya, dengan menyediakan energi di lingkungan keju yang kekurangan gula), untuk keamanan keju (misalnya, dengan produksi amina biogenik melalui dekarboksilasi Tyr, His, Trp ), dan untuk produksi senyawa rasa dan aroma (Pierro et al., 2010). Pemecahan para-kasein menjadi asam amino dan peptida oleh kombinasi chymosin dan proteinase dan/atau peptidase dari bakteri starter umumnya dianggap sebagai aspek terpenting dari pematangan keju (Parente dan Cogan, 2004). Metabolisme lainnya Kecuali untuk Parmigiano Reggiano, Pecorino dan keju Italia terkait, dan keju Biru, lipolisis terbatas terjadi pada keju selama pematangan (Hickey et al., 2007; Voigt et al., 2010).
☣
Namun demikian, tingkat terbatas, yang memang terjadi, dianggap penting untuk rasa dan persepsi rasa. Esterase telah dimurnikan dari beberapa starter dan BAL, termasuk Lc. lactis (Holland dan Coolbear, 1996; Chich et al., 1997), Sc. thermophilus (Liu et al., 2001) dan Lb. plantarum (Gobbetti et al., 1997). Semuanya adalah enzim serin yang secara istimewa menghidrolisis ester butirat dan aktif secara optimal pada pH 7. Beberapa dari mereka tidak memiliki aktivitas pada pH 5.0; namun, sejumlah kecil aktivitas dalam waktu lama dapat memicu hidrolisis lemak yang signifikan selama pematangan keju. Tributirin esterase utama dari Lc. lactis telah dikloning, diekspresikan secara berlebihan dan dikarakterisasi (Fernandez et al., 2000). Enzim yang dimurnikan menunjukkan preferensi untuk ester asil rantai pendek dan juga fosfolipid, menunjukkan bahwa itu mungkin terlibat dalam metabolisme fosfolipid in vivo (Dherbécourt et al., 2008). Persiapan Pemula Starter laktat harus melakukan salah satu fungsi teknologinya (produksi asam) di awal pembuatan keju dan kultur aktif metabolik dalam jumlah yang cukup harus dipakai untuk menginokulasi susu keju. Biasanya, populasi awal starter dalam susu keju adalah sekitar 1-5 x 106 cfu/ml pada inokulasi dan mencapai 1-10 x 108 cfu/ml ketika dadih dipindahkan ke cetakan, biasanya 5-6 jam kemudian dalam kasus ini. dari keju Cheddar. Pada kebanyakan keju, selama waktu ini, pH harus turun dari ~6,6 menjadi <5,5; sel-sel yang tidak sepenuhnya aktif atau stres sub-mematikan pada inokulasi akan menunjukkan pertumbuhan yang lebih lambat dan akibatnya produksi asam lebih lambat, sehingga meningkatkan waktu pembuatan keju. Kecuali starter alami, sebagian besar pabrik keju memakai kultur yang disediakan dalam salah satu dari beberapa bentuk (cair, beku, kering beku) oleh industri khusus. Pendekatan tradisional untuk pembuatan kultur starter untuk inokulasi susu keju, yang memerlukan sejumlah langkah dari volume kecil (1 ml atau g) kultur stok hingga volume besar (100-1000 1) starter massal, masih dipakai (Parente dan Cogan, 2004). Namun, hal itu digantikan oleh pemakaian kultur beku atau beku-kering untuk inokulasi langsung susu starter curah atau susu keju secara langsung, terutama di pabrik pembuat keju kecil. Contoh produksi kultur starter laktat di pabrik keju dapat dilihat pada Gambar 12.
☤
Perbanyakan Biang Ragi Pemula Produksi biang ragi starter memerlukan pemilihan media dan kondisi operasi yang cermat untuk mendapatkan hasil optimal dalam hal jumlah sel akhir, aktivitas (pertumbuhan cepat, fase lag berkurang, produksi asam yang sesuai, produksi aroma, kemampuan proteolitik), stabilitas pada penyimpanan dan, dalam kultur campuran, komposisi starter. Ini, pada gilirannya, dipengaruhi oleh beberapa faktor, termasuk adanya fag yang mengganggu, komposisi media dan kondisi fermentasi (antara lain perlakuan panas, kontrol suhu dan pH selama fermentasi, durasi inkubasi, suhu penyimpanan). Meskipun susu keju adalah media tradisional untuk pertumbuhan starter di pabrik keju, telah digantikan oleh susu skim (RSM) bebas antibiotik yang telah diuji sebelumnya dan dengan media starter yang dirancang khusus, tersedia dari perusahaan kultur starter (Parente dan Cogan , 2004). Ketersediaan RSM yang telah diuji sebelumnya memungkinkan kontrol pertumbuhan yang lebih baik sebelum inokulasi susu dalam tong keju. Ini dapat dilarutkan ke tingkat padat yang lebih tinggi daripada susu segar, sehingga meningkatkan kapasitas buffer dan oleh karena itu pertumbuhan dan aktivitas kultur. Menggandakan konsentrasi padatan dalam RSM dari 8 menjadi 16% biasanya menghasilkan penggandaan jumlah sel yang layak (dari 5-7 x 108 menjadi 10-14 x 108 cfu/ml) dengan pH akhir yang lebih tinggi (dari 4,5 menjadi 4,7). Hasil serupa dapat diperoleh dengan meningkatkan padatan susu dengan ultrafiltrasi (Karlsson et al., 2007).
Gambar 12 Diagram langkah-langkah produksi starter laktat Sumber: Parente dan Cogan (2004) Kontrol pH penting untuk membangun biomassa starter, mencegah stres asam dan hilangnya aktivitas, dan mengendalikan rasio spesies dan strain dalam biang ragi campuran (Oberg dan Broadbent, 1993; Whitehead et al., 1993; Sandine, 1996). Sementara lactobacilli dan leuconostocs relatif tahan asam, kokus mesofilik dan termofilik dengan cepat dihambat ketika pH turun di bawah 5,5. Oleh karena itu, rasio batang:kokus starter termofilik dapat dipengaruhi secara
☥
signifikan oleh pH dan pH selama inkubasi, kontrol pH juga memungkinkan konsumsi lengkap sumber karbohidrat dan retensi viabilitas selama penyimpanan dingin yang berkepanjangan dari kultur dewasa (Sandine, 1996). ). Namun, kontrol pH internal tidak cocok jika pH kultur harus dipertahankan pada nilai yang tetap, tangki starter curah terkontrol pH, dilengkapi dengan elektroda yang dapat disterilkan untuk pengukuran pH dan kontrol komputer dengan penambahan alkali otomatis untuk mengontrol pH pada suhu yang diinginkan. set point sekarang sudah tersedia. Penetral yang paling umum dipakai dalam kontrol pH eksternal adalah KOH, NH4OH dan gas amonia. NaOH dan Na2CO3 lebih murah tetapi beberapa starter dapat dihambat oleh konsentrasi Na+ yang tinggi (Parente dan Cogan, 2004). Faktor proses lain yang mempengaruhi pertumbuhan dan kinerja starter adalah perlakuan panas media pertumbuhan, dan suhu serta lama inkubasi (Sandine, 1996). Kombinasi waktu/suhu yang dipakai selama perlakuan panas jauh lebih tinggi (biasanya 80-90°C selama 10-30 menit; suhu yang lebih tinggi dapat dipakai dalam produksi komersial starter termofilik) Dibandingkan pasteurisasi komersial (72°C pada 16 detik). Kondisi seperti itu secara drastis mengurangi mikroflora dalam medium, memastikan penghancuran fag, yang tahan terhadap pasteurisasi, dan mengurangi potensi redoks, mengusir oksigen dan mendenaturasi protein, sehingga meningkatkan pertumbuhan starter (Oberg dan Broadbent, 1993). Suhu inkubasi dapat sangat mempengaruhi komposisi starter dalam kultur campuran. Inkubasi pada 18--21°C biasanya lebih disukai untuk kultur laktokokus dan leukonostok, karena kedua organisme memiliki laju pertumbuhan yang kira-kira sama dalam kisaran suhu ini, sementara laktokokus tumbuh lebih cepat pada 30°C Untuk kultur batang termofilik:kokus, kompromi (42°C harus ditemukan antara suhu optimum Sc. thermophilus yang cukup termofilik (37-39°C dan suhu termofilik Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus dan Lb. helveticus (45°C meskipun simbiosis antara komponen kultur dapat mengatasi masalah yang ditimbulkan). dengan pertumbuhan pada suhu sub-optimal (Oberg dan Broadbent, 1993) Kultur mesofilik aktif mencapai fase diam dalam media susu dalam 6-8 jam pada 30°C dan dalam 16-18 jam pada 18-2°C kombinasi terakhir jelas lebih cocok untuk inkubasi semalaman Kultur termofilik dapat mencapai fase diam dalam 6-8 jam pada 37°C (Parente dan Cogan, 2004).
☦
Pelestarian Distribusi Biang Ragi Pemula Sementara kultur stok biasanya disimpan di pabrik keju hanya untuk waktu yang terbatas, produksi dan distribusi kultur starter secara komersial memerlukan sarana yang sesuai untuk pengawetan dan distribusi kultur dalam keadaan sangat aktif. Kultur dapat diawetkan dengan berbagai cara (pendinginan kultur cair, pengeringan, pembekuan, pengeringan beku) yang memaparkan kultur ke berbagai tekanan sub-letal dan mematikan (van de Guchte et al., 2002) yang secara negatif mempengaruhi vitalitas dan aktivitas (dengan merusak sel secara sub-mematikan, dengan membunuh secara selektif beberapa komponen kultur sehingga mengubah komposisi kultur). Sel-sel yang stres sub-mematikan membutuhkan fase jeda yang lebih lama untuk pulih, yang diterjemahkan menjadi kebutuhan akan resusitasi yang lebih lama (Parente dan Cogan, 2004). Secara historis, kultur telah diproduksi dan didistribusikan dalam bentuk cair, dalam bentuk kering udara (spray dry), sebagai kultur beku dan kultur beku-kering. Dua cara pengawetan yang terakhir dipakai paling luas di industri pemula saat ini. Pendinginan kultur cair adalah metode pengawetan dan distribusi kultur tertua. CaCO3 biasanya ditambahkan ke dalam susu untuk mempertahankan pH tinggi dan biakan disimpan pada suhu rendah 2-5°C Stabilitas tidak melebihi 1 atau 2 minggu dan diperlukan beberapa kali pemindahan untuk mendapatkan biakan aktif (Sandine, 1996; Parente dan Cogan , 2004). Pembekuan pada suhu yang sangat rendah (-80°C sampai -196°C) dengan adanya agen cryoprotective adalah cara terbaik untuk melestarikan vitalitas dan aktivitas bakteri, dan pembekuan merupakan langkah awal dalam produksi kultur beku-kering. Beberapa faktor yang mempengaruhi kelangsungan hidup BAL selama pembekuan dan aktivitasnya sesudah pencairan, misalnya spesies, strain, komposisi media pertumbuhan, kondisi kultur, fase pertumbuhan, komposisi media yang dipakai untuk menangguhkan sel selama pembekuan, jenis dan konsentrasi agen krioprotektif, suhu dan laju pembekuan, suhu penyimpanan, suhu dan laju pencairan (Sandine, 1996). Kokus mesofilik dan termofilik lebih tahan daripada laktobasilus termofilik dan leuconostocs; oleh karena itu, perawatan harus dilakukan dalam pembekuan kultur campuran untuk menjaga keseimbangan regangan yang benar (Parente dan Cogan, 2004). Sementara menghilangkan air pada suhu sekitar merugikan kelangsungan hidup dan aktivitas kultur starter, pengeringan beku, yaitu, menghilangkan air dari kultur beku dengan sublimasi di bawah vakum tinggi, menghasilkan tingkat kelangsungan hidup yang tinggi. Pengeringan beku telah dipakai untuk persiapan starter susu selama sekitar satu abad (Sandine, 1996). Stok beku-
☧
kering yang mengandung 108-109 cfu/g dikirim ke pabrik keju dalam vial, botol serum atau kantong yang berisi beberapa gram bubuk dan memerlukan beberapa transfer untuk reaktivasi penuh. Kultur beku dan beku-kering konvensional tidak mengandung sel yang cukup untuk inokulasi tangki starter massal atau susu keju dan oleh karena itu beberapa transfer diperlukan untuk membangun inokulum yang cukup untuk starter massal. Starter pekat beku dan kering beku, biasanya mengandung 1010 - 1011 cfu/g dan 1011-1012 cfu/g, masing-masing, untuk inokulasi starter curah (juga dikenal sebagai set curah) atau susu keju (kultur langsung ke tong). Biang ragi set tong langsung) sekarang tersedia dari perusahaan pemula (Miao et al., 2008). Konsentrat beku sebagian dicairkan dengan memasukkan wadah ke dalam air terklorinasi (25-50 mg/kg) pada suhu kamar selama 20 menit sebelum menambahkannya ke susu, di mana pencairan selesai dalam 15-30 menit. Starter beku-kering dapat ditambahkan langsung ke tangki starter massal atau tong keju, meskipun rehidrasi dalam volume kecil susu disarankan untuk meningkatkan distribusi. Karena aktivitasnya yang tinggi, kultur konsentrat beku untuk inokulasi tong langsung tidak secara signifikan meningkatkan waktu pembuatan keju, dan dipakai secara luas di AS dan Australia. Di sisi lain, kerusakan sub-letal yang dipicu oleh pengeringan beku dapat meningkatkan waktu pembuatan keju 0,5-1 jam (Sandine, 1996); namun, kerugian ini mungkin diimbangi oleh fakta bahwa pengiriman dan penanganan starter beku-kering sangat disederhanakan, dan konsentrat beku-kering lebih banyak dipakai di Eropa. Pengawetan kultur asam laktat dengan pengeringan semprot telah dipelajari secara luas sebagai proses industri alternatif untuk pengawetan kultur starter asam laktat karena biaya tinggi dan konsumsi energi pembekuan dan pengeringan beku. Seperti pada tahun 2004, perhatian khusus telah diberikan pada faktor-faktor yang mempengaruhi viabilitas sel termasuk toleransi intrinsik kultur, media dan kondisi pertumbuhan, induksi stres, kondisi pemanenan sel, agen pelindung, kondisi rehidrasi, kondisi pengemasan dan penyimpanan (Peighambardoust et al., 2011). Bakteriofag dalam Biang Ragi Pemula Bakteriofag berhubungan dengan sebagian besar spesies bakteri dan oleh karena itu ada di mana-mana di lingkungan di mana inang bakteri mereka ditemui. Bakteriofag yang menginfeksi Lactococcus pertama kali diidentifikasi oleh Whitehead dan Cox (1935) dan sejak itu dikenal sebagai penyebab utama gangguan pada fermentasi susu. Dalam industri susu modern, gangguan
☨
fermentasi asam laktat oleh bakteriofag dapat memicu kerugian ekonomi yang serius. Meskipun kemajuan teknologi dalam proses fermentasi dalam hubungannya dengan rezim sanitasi yang ketat mungkin telah mengurangi kejadian infeksi bakteriofag, hal itu tentu tidak menghilangkannya. Masalah infeksi bakteriofag yang persisten telah memfokuskan penelitian pada pengembangan strain starter yang resisten terhadap fag (Parente dan Cogan, 2004). Penelitian awalnya terkonsentrasi pada fag yang menginfeksi Lactococcus spp., tetapi baru-baru ini minat telah meluas ke fag BAL lainnya, seperti yang menginfeksi Lactobacillus spp. dan Sc. thermophilus (McGrath et al., 2004). Munculnya alat penelitian biologi molekuler, seperti pengurutan DNA otomatis dan bioinformatika, telah memungkinkan penentuan urutan lengkap dari jumlah genom bakteriofag LAB yang masih terus bertambah. Klasifikasi fag BAL berdasarkan homologi DNA akan mengevaluasi seluruh genom fag yang bertentangan dengan bagian tertentu, yang dapat mengkodekan, misalnya, gen struktural. Berdasarkan studi hibridisasi DNA:DNA, dua belas spesies fag laktokokus yang berbeda secara genetik telah ditentukan (Jarvis et al., 1991). Sumber Kontaminasi Fag dapat berasal dari berbagai sumber. Sangat penting untuk mengetahui sumber potensial fag untuk membatasi masuknya fag ke dalam fasilitas manufaktur, yang dapat merusak proses fermentasi. Setiap bahan alami mentah yang masuk ke fasilitas fermentasi mungkin mengandung fag, meskipun pada tingkat yang rendah. Misalnya, susu mentah, yang merupakan ceruk ekologis untuk beberapa BAL, diketahui mengandung fag (Moineau dan Levesque, 2005). Karena susu dikumpulkan dari peternakan yang berbeda, keanekaragaman hayati fag diperkuat dalam silo susu. Karena fag dapat dengan mudah menyebar dalam media cair seperti susu dan karena fag juga dapat berdifusi dalam media seperti gel, hanya beberapa sel sensitif yang diperlukan untuk meningkatkan kadar fag secara cepat dalam lingkungan tertentu (Muller-Merbach et al., 2007) . memakai metode PCR multipleks, fag laktokokus dan streptokokus telah terdeteksi pada 37% sampel susu yang dipakai untuk produksi yogurt di Spanyol (del Rio et al., 2007), sedangkan pendekatan mikrobiologis menunjukkan bahwa 9% sampel susu dari berbagai wilayah geografis di Spanyol mengandung fag L. lactis (Madera et al., 2004). Angka-angka ini bisa lebih tinggi dalam sampel whey atau produk akhir karena fag dapat menyebar selama sebagian besar proses fermentasi
☩
(Madera et al., 2004). Titer setinggi 109 CFU per ml whey keju telah dilaporkan (Atamer et al., 2009). Industri fermentasi susu dapat memakai kembali protein whey untuk meningkatkan rasa atau tekstur produk akhir, untuk meningkatkan nilai gizinya (Fox, 2000), untuk menstandarisasi susu sebelum proses fermentasi atau untuk meningkatkan hasil (Hinrich, 2004). Pada konsentrasi whey atau protein susu, fag dapat tetap berada dalam konsentrat protein whey (cair atau kering) dan mencemari produk yang ditambahkannya (Chopin, 1980). Salah satu sumber fag yang dirasakan adalah kultur starter itu sendiri. Ketika fag sedang memasuki suatu strain, ia dapat memulai siklus litik atau genomnya dapat berintegrasi ke dalam kromosom bakteri dan mengikuti multiplikasi bakteri. Ketika bakteri membawa profag seperti itu, selnya disebut lisogen. Stres bakteri yang berbeda seperti panas, garam, antimikroba, kelaparan atau UV dapat menginduksi profag dan memicu siklus litik (Lunde et al., 2005; Madera et al., 2009). Dengan demikian, pemakaian strain lisogenik dalam kultur starter dapat memicu lisis sel selama fermentasi. Induksi juga dapat terjadi secara alami dan dapat mencapai frekuensi hingga 9% (Madera et al., 2009). Prophages dibawa oleh banyak strain BAL (Durmaz et al., 2008) dan seringkali lebih dari satu profage ditemukan dalam genom. Analisis terbaru mengungkapkan bahwa 25 dari 30 komersial, koleksi atau susu yang diisolasi Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei dan Lactobacillus rhamnosus ditemukan membawa profag yang dapat diinduksi (Mercanti et al., 2011). Baru-baru ini, keberadaan fag lactococcal di udara di pabrik keju diselidiki karena jarang didokumentasikan (Neve et al., 2003). Tingkat fag udara yang tinggi di lingkungan dapat berarti bahwa perbanyakan fag telah terjadi sebelumnya atau kemungkinan masalah fag akan terjadi. Jumlah besar susu yang diproses setiap hari di tong keju terbuka, serta pemrosesan whey, pasti memicu percikan cairan dan aerosolisasi fag (Moineau dan Levesque, 2005). Virus bakteri ini juga dapat menjadi aerosol oleh perpindahan udara di sekitar permukaan cairan yang terkontaminasi dan diangkut ke tempat lain di pabrik (Garneau dan Moineau, 2011). Pengendalian Bakteriofag di Pabrik Susu Sejak fag laktokokus pertama kali diidentifikasi, sejumlah strategi untuk mengurangi dampaknya dalam fermentasi susu telah dikembangkan. Pabrik susu modern dirancang khusus untuk mengurangi kejadian infeksi fag. Area persiapan kultur starter umumnya terpisah secara
☪
fisik dari area produksi, dengan akses terbatas untuk menghindari kontaminasi silang oleh personel. Pemeliharaan sedikit tekanan positif di ruang starter juga mengurangi risiko kontaminasi dengan fag dari lingkungan pabrik. Tindakan lebih lanjut meliputi pemanasan media starter curah (≥90°C selama minimal 20 menit) dan penyaringan udara pendingin memakai filter udara partikulat efisiensi tinggi (HEPA). Tong fermentasi tertutup telah diperkenalkan dan peralatan yang bersentuhan dengan susu disanitasi baik dengan mengukus atau dengan desinfeksi dingin dengan klorin dan asam perasetat (Cogan dan Hill, 1994; Limsowtin et al., 1996; Stanley, 1998). Secara tradisional, persiapan starter massal melibatkan beberapa langkah peningkatan dari kultur induk melalui kultur perantara hingga starter massal akhir. Proses ini bisa memakan waktu dan mungkin memberi kesempatan bagi fag yang bermasalah untuk berkembang biak. Temuan bahwa sebagian besar fag Lactococcus memiliki ketergantungan mutlak pada ion kalsium untuk keberhasilan infeksi (Reiter, 1956) telah memfasilitasi pengembangan media penghambat fag, yang menggabungkan agen pengkelat Ca2+, seperti fosfat atau sitrat. Berbagai langkah lain dapat diambil untuk meminimalkan risiko infeksi fag dan telah ditinjau di tempat lain (Cogan dan Hill, 1994; Limsowtin et al., 1996; Stanley, 1998). Proses persiapan starter massal dapat dielakkan melalui pemakaian kultur pekat beku atau beku-kering yang tersedia secara komersial. Berbagai jenis tersedia dan dapat dipakai baik untuk menginokulasi starter curah atau susu dalam tong keju secara langsung (pengaturan langsung) (Limsowtin et al., 1996). Sistem Resistensi Bakteriofag Alami di LAB Sejak bakteriofag pertama kali diidentifikasi sebagai penyebab utama kegagalan fermentasi susu, banyak upaya penelitian telah diarahkan pada pengembangan sistem fageresistansi untuk dipakai dalam industri susu. Sebagian besar penelitian ini hingga saat ini berfokus pada galur laktokokus, meskipun baru-baru ini, upaya juga telah dilakukan dengan Sc. thermophilus (Moineau, 1999; Coffey dan Ross, 2002). Sistem fageresistansi yang terjadi secara alami telah diidentifikasi pada galur Lactococcus tipe liar. Sistem ini sering dikodekan pada plasmid konjugatif asli, yang telah memfasilitasi generasi strain starter resisten baru melalui teknik transfer gen food grade. Sistem resistensi ini telah dibagi menjadi empat kelompok utama berdasarkan cara kerjanya: (1) penghambatan adsorpsi fag, (2) penyumbatan injeksi DNA fag, (3) restriksi/modifikasi dan (4) infeksi yang gagal. (Coffey dan Ross, 2002; Deveau et al., 2008; Garneau dan Moineau, 2011).
✫
Sistem penghambatan adsorpsi berkode plasmid asli telah diidentifikasi dalam lactococci dan telah ditemukan bahwa sistem ini dapat dipisahkan berdasarkan mekanisme molekuler yang dipakai . Plasmid ini umumnya mengarahkan sintesis antigen permukaan sel atau memediasi produksi polisakarida ekstraseluler yang melindungi reseptor fag inang terhadap perlekatan fag (Valyasevi et al., 1990, 1994; Schafer et al., 1991; Forde et al., 1999) . Garvey et al. (1996) adalah yang pertama melaporkan identifikasi mekanisme pemblokiran injeksi yang disandikan plasmid. Mereka menunjukkan bahwa plasmid pNP40 Lactococcus yang terjadi secara alami memberikan mekanisme resistensi kerja awal terhadap bc2. sesudah infeksi dengan bc2, tidak ada perbedaan dalam adsorpsi fag yang dicatat; namun, 90% sel yang menyimpan pNP40 tetap hidup sedangkan galur kontrol tanpa pNP40 pada dasarnya tidak menunjukkan kelangsungan hidup. Lebih lanjut, mekanisme resistensi ini dapat dielakkan dengan elektroporasi DNA fag ke dalam sel inang yang resisten, di mana sel yang ditransfeksi ini melepaskan fag keturunan. Sistem restriksi/Modifikasi harus menunjukkan dua aktivitas enzimatik, yaitu restriksi endonuklease dan metilase, dan juga harus mampu menemukan urutan pengenalan DNA-nya (McGrath et al., 2004). Metilase memodifikasi situs pengenalan pada DNA inang, sehingga melindunginya dari pembatasan oleh endonuklease, sedangkan urutan pengenalan yang tidak dimodifikasi pada molekul DNA asing atau penyerang secara khusus dicerna (Wilson dan Murray, 1991). Infeksi abortif adalah istilah yang dipakai untuk menjelaskan secara luas mekanisme resistensi fag yang mengganggu perkembangan fag intraseluler sesudah DNA fag memasuki sel (McGrath et al., 2004). Oleh karena itu, menurut definisi, sistem infeksi yang gagal dapat mengganggu proses seperti replikasi genom, transkripsi/translasi, pengemasan dan perakitan DNA fag, dan lisis sel. Infeksi abortif umumnya ditandai dengan infeksi yang dilemahkan karena jumlah infeksi produktif yang lebih rendah dan penurunan jumlah progeni fag yang dihasilkan (Allison dan Klaenhammer, 1998). Resistensi yang dimediasi infeksi yang gagal biasanya memuncak pada kematian sel yang terinfeksi karena kerusakan fungsi inang, sebagai akibat dari aktivitas pertahanan.
✢
Mikrobiologi Pematangan Keju Mikroorganisme, termasuk bakteri, ragi dan kapang, hadir dalam keju selama pematangan dan berkontribusi secara positif pada proses pematangan baik secara langsung melalui aktivitas metabolismenya atau secara tidak langsung melalui pelepasan enzim ke dalam matriks keju melalui autolisis. Pembuat keju mendorong pertumbuhan organisme ini ; namun, mikro-organisme lain, seperti patogen bawaan makanan, memiliki dampak negatif pada kualitas keju, dan dengan demikian diperlukan teknologi untuk menghilangkan atau mencegah masuknya mereka ke dalam keju. Mikroflora yang terkait dengan pematangan keju sangat beragam; namun, dapat dengan mudah dibagi menjadi dua kelompok- bakteri asam laktat starter (BAL) dan mikroflora sekunder. Bakteri starter terutama bertanggung jawab untuk produksi asam selama pembuatan dan, dengan demikian, harus mampu menghasilkan asam yang cukup untuk mengurangi pH susu dengan cepat; aturan praktis yang berguna adalah pH<5,3 dalam susu dalam 6 jam pada suhu 30-37°C tergantung pada varietas keju (Beresford dan Williams, 2004). Mikroflora sekunder tidak berperan aktif selama pembuatan keju tetapi terlibat dengan bakteri starter dalam proses pematangan. Saat mempelajari mikroorganisme dalam keju, penting bahwa flora lengkap dipantau dan komponen individu diidentifikasi dan dikarakterisasi secara akurat. Pendekatan yang dipakai untuk mencapai tujuan ini meliputi metode yang: (1) bergantung pada budidaya diikuti dengan karakterisasi fenotipik, (2) bergantung pada budidaya diikuti dengan karakterisasi molekuler dan (3) secara kultur-metode independen (Cogan dan Beresford, 2002; Beresford dan Williams, 2004) Mikroorganisme masuk ke dalam keju baik dengan penambahan yang disengaja sebagai bagian dari kultur starter atau secara alami terkait dengan bahan yang dipakai dalam produksi keju. Dengan demikian, teknologi manufaktur sangat penting untuk mendefinisikan keanekaragaman hayati flora keju. Susu dalam ambing hewan yang sehat pada dasarnya steril; namun, selama pemerahan dan penyimpanan, peluang terjadinya kontaminasi. Susu yang diekstraksi dari ambing di tingkat peternakan di bawah kondisi pemerahan yang higienis secara rutin dapat mengandung <5 x 103 cfu/ml (Fox et al., 2000). Kecepatan dan derajat pendinginan susu sesudah pemerahan memiliki dampak yang signifikan terhadap flora mikroba. Susu yang didinginkan pada suhu 15-21°C didominasi oleh mikroorganisme mesofilik, terutama spesies Lactococcus dan Enterobacter (Bramley dan McKinnon, 1990). Mendinginkan susu hingga 4°C
✣
akan sangat menghambat pertumbuhan sebagian besar mikroorganisme, tetapi bakteri psikrotrofik, seperti Pseudomonas, Flavobacterium dan Acinetobacter akan terus tumbuh perlahan dan mendominasi flora. Pasteurisasi, yang merupakan bagian dari proses pembuatan untuk sebagian besar keju komersial membunuh ~99,9% bakteri yang ditemukan dalam susu mentah. Namun, spora Bacillus dan Clostridium dan organisme termodurik, misalnya Micrococcus, Microbacterium dan Enterococcus, akan bertahan dari pasteurisasi dan masuk ke dalam keju. Bakteri Pemula Fungsi utama bakteri starter adalah untuk
.jpeg){kind=small}